海洋環境中硫酸鹽還原菌的快速測定方法研究

2021-03-26 03:14:01 hualin 4

  “一帶一路”、“海洋強國戰略”等重大戰略規劃為我國海洋經濟帶來了前所未有的發展機遇。海洋工程裝備和船舶在服役過程中不可避免的要遇到各種腐蝕問題,其中由微生物引起的,或者由于其群體效應或代謝過程引起的腐蝕行為變化稱做微生物腐蝕。微生物腐蝕幾乎可以在所有常用工程材料表面發生,微生物腐蝕約占整個腐蝕的20%。作為微生物腐蝕研究的代表性微生物,也是研究最廣泛的腐蝕微生物,硫酸鹽還原菌 (SRB) 是一類能夠利用SO42-為電子受體異化有機物質并從中獲取能量的微生物,其參與的腐蝕過程約占所有微生物腐蝕的50%[1,2]。SRB廣泛存在于海洋環境中,參與了工程材料在海洋底泥區、全浸區、潮差區和飛濺區的腐蝕過程,是一類不容忽視的腐蝕因子。

針對SRB加速腐蝕的機理研究已經經歷了一個多世紀,目前已經形成的機理包括陰極去極化機理、濃差電池機理、代謝產物機理、酸腐蝕機理和電子直接傳遞機理等[3,4,5,6]。SRB的代謝活性與其腐蝕行為密切相關是這些機理的共識觀點之一。如陰極去極化機理認為,SRB能夠利用腐蝕陰極反應產生的氫原子參與SO42-的代謝過程,進而加速陰極反應平衡的移動,加速金屬的溶解過程。濃差電池理論認為,SRB的生長代謝過程會降低在材料附近氧氣的濃度,形成氧濃差電池,從而加速金屬材料的腐蝕過程。代謝產物機理認為,SRB代謝產生的硫化物不僅本身對腐蝕反應具有陰極和陽極去極化作用,生成的硫鐵化合物也具有去極化作用,同時硫化物還會破壞氧化物保護膜生成局部酸環境。酸腐蝕機理認為,SRB在代謝的過程中會不斷產生低碳鏈的脂肪酸,這些脂肪酸,最主要的是醋酸,會造成局部環境pH值降低,從而加速對金屬材料的破壞。電子直接傳遞機理認為,自養型SRB能夠直接從金屬基底材料獲取電子參與其細胞代謝過程,導致腐蝕速率的顯著增加,而不產生氫消耗。


然而,現有研究仍無法明確SRB狀態對其腐蝕行為的影響程度和作用規律,其中一個重要原因是缺乏快速、準確、連續的SRB狀態測定方法,導致無法及時獲取關于SRB的種群濃度、生長狀態和代謝效能信息。此外,受限于復雜的海洋環境,繁瑣的微生物腐蝕樣品采集流程,和電化學測試信號易被其它腐蝕行為掩蓋等困難,目前仍沒有合適的技術可以實現微生物腐蝕過程的實時監測。有研究報道,工程材料表面SRB的種群濃度和代謝活性可以為微生物腐蝕的發生提供指示[7]。因此,開發新型快速的SRB狀態測定方法具有重要意義,能為深入揭示SRB在腐蝕過程中的作用機理,開發微生物腐蝕狀態的快速監測技術提供重要依據。

目前,檢測SRB種群濃度最常用的方法還是傳統的最大可能數 (MPN) 法,該方法是由Abd-El-Malek等[8]在1958年首次提出。該方法將SRB進行逐級梯度稀釋后進行定期培養,利用其代謝產生的硫化物與亞鐵離子反應顯色確定SRB的存在,根據稀釋的倍數和呈現陽性顯色樣品的個數確定初始樣品中SRB種群的濃度。雖然Vester等[9]在1998年對MPN法進行了改進,但該類方法仍然需要經歷至少15 d才能完成整個檢測過程,且操作過程繁瑣,是一種既耗時又耗力的檢測手段;同時過長的檢測周期,使其檢測結果并不能準確、實時地反映環境中SRB的種群數量,不利于施工和殺菌措施的調整。除最常用的MPN法外,目前已報道的其它SRB檢測技術手段可以分為:基于SRB特征物質的檢測方法,基于SRB細胞的檢測方法以及基于SRB遺傳物質的檢測方法,這些檢測技術均存在一定的缺陷與不足。例如,基于SRB特征化合物 (如腺苷酰硫酸還原酶) 的檢測方法靈敏度及選擇性均不高,且需要破壞SRB細胞結構[10];基于SRB細胞識別的檢測方法 (如酶聯免疫標記法) 受生物識別材料與生物標記材料的活性影響較大,檢測信號不穩定[11];基于分子技術 (如聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性) 的分析方法需要較高的檢測成本和專業人員操作[12]。因此,現有的SRB檢測技術均存在普遍性與穩定性的不足,距離實際需求仍有較大的距離。

此外,目前常用的SRB活性測定方法是通過分析培養體系中營養物質的消耗情況和硫化物的積累量進行分析[13,14],該類方法受環境影響較大,尤其在開放體系研究時,營養物質的循環和硫化物的揮發均會對測定產生較大影響。同時,該類方法測定的是體系中SRB種群整體的代謝活性,無法實現材料表面固載細菌和溶液游離細菌活性的獨立測定和區分。另一類基于微電極傳感器的活性測定方法是通過解析生物膜表面硫化物的濃度變化確定SRB生物膜活性,然而該類方法對儀器設備和操作的要求較高[15,16,17],不適合現場和大規模應用。因此,現有測定技術均不能滿足實際研究和應用的需求,無法快速、準確、連續的獲得SRB的活性狀態信息,開發新型的SRB代謝活性測定方法已成為微生物腐蝕研究的迫切需求。


事實上,海洋環境與SRB代謝過程非常復雜,目前常用SRB分析測量技術易受到非特異性吸附和干擾物質的影響,檢測的準確度和重現性會有一定程度的降低。另一方面,現代科學研究和實際應用對微生物檢測的需求已從單一宏觀信號提升為單細胞的觀測與分析,檢測過程與結果需更加生動、形象。因此,引入其它新型檢測技術實現環境中SRB種群濃度和代謝活性的快速檢測分析已十分必要。


本文將簡要介紹本課題組在SRB種群濃度和代謝活性檢測方面的研究進展,闡述各類方法的優缺點、適用條件及檢測性能,為后續SRB狀態檢測方法的發展及實用化提供參考。

1 SRB種群濃度快速測定方法研究進展

針對現有SRB檢測方法的缺陷與不足,研究從微生物識別方式角度出發,實現了海洋環境中腐蝕微生物SRB的快速檢測,將整個SRB檢測流程縮短至2 d以內,有望部分甚至完全取代現有檢測技術,具有較好的應用前景。

1.1 基于微生物細胞結構識別SRB的檢測方法

為提升檢測靈敏度及選擇性,研究以海洋腐蝕微生物SRB細胞膜為識別目標,借助化學合成及電化學技術,構建了一系列快速檢測技術,保證了SRB細胞檢測的選擇性,縮短了檢測時間。主要進展如下:構建了無標記電化學快速檢測平臺實現了SRB的快速檢測,其中多巴胺自激發檢測平臺 (圖1) 是通過多巴胺在堿性溶液中的自聚合反應形成的聚多巴胺膜直接固定抗體作為識別平臺,提升了檢測平臺的生物相容性,保證了生物識別材料的識別活性及檢測選擇性[18];三維泡沫鎳結構檢測平臺是通過在三維鎳結構修飾納米金顆粒為固定抗體作為識別平臺,提升了識別材料的固載效率,同時該三維結構能夠有效放大檢測信號,有效提升了檢測靈敏度[19];分子自組裝檢測平臺借助共價修飾結合無標記的電化學阻抗技術,實現了SRB的檢測和分析,實現了SRB檢測平臺的有效構建,并具有良好的檢測性能[20]。

3c95e041-3222-4b48-88eb-e2271c6a72b1-F001.jpg

圖1   多巴胺自激發檢測平臺的構建流程及檢測性能評價[18]


其次,構建了納米信標電化學平臺實現了SRB的快速檢測,其中氧化石墨烯標記檢測平臺 (圖2) 是以高效新型納米材料氧化石墨烯納米片的高催化活性放大檢測信號,進而實現了檢測信號的有效放大,大大提升了檢測靈敏度[21];納米MnO2標記檢測平臺是以MnO2納米材料作為信號標簽,借助MnO2納米材料催化性能實現SRB檢測,具有更高的穩定性和更廣的使用環境[22];殼聚糖電聚合檢測平臺是通過可控的電沉積技術制備石墨烯摻雜的殼聚糖膜固定抗體作為識別平臺,實現了生物識別材料固載平臺的可控調控,保證了檢測平臺的穩定性與均一性,同時具有較高的生物相容性[23]。

3c95e041-3222-4b48-88eb-e2271c6a72b1-F002.jpg

圖2   氧化石墨烯標記檢測平臺的構建流程及檢測性能評價[21]


此外,開發了新型SRB特異性識別平臺,其中生物印跡薄膜檢測平臺 (圖3) 采用細胞介導技術在電極表面制備了能夠識別SRB細胞的生物印跡薄膜,該技術具有價格低廉、穩定性好、適用范圍廣的優點[24];抗生素磁性分離檢測平臺通過特異性識別SRB細胞壁前質末端的D-Ala-D-Ala結構契合,借助石英晶體微天平技術對SRB進行測試分析。整個流程無需生物分子固定和修飾步驟,大大縮短了檢測所需時間[25]。多巴胺增強聚合檢測平臺是構建了一種多功能的簡便的信號放大體系,借助多巴胺材料增強聚合的過程實現生物材料及信號分子的有效固載,進而實現檢測信號的靶向放大,提升了檢測靈敏度[26]。

3c95e041-3222-4b48-88eb-e2271c6a72b1-F003.jpg

圖3   基于生物印跡薄膜檢測平臺的構建示意圖及檢測性能圖[24]


基于微生物細胞結構識別SRB的檢測方法靈敏度高,選擇性好,檢測時間短,能夠在2 h以內完成檢測過程,較易實現自動化檢測。然而,大部分這類方法需要借助生物識別材料實現目標微生物的特異性結合,生物材料的活性易受到測試環境的干擾,且生物材料價格昂貴,不能重復使用。另外,生物材料過高的特異性也限制了其在實際環境檢測中的應用,因為環境中SRB的種群數量巨大,目前已有40個屬137種SRB被報道,每一種SRB的細胞成分都不盡相同。因此,基于微生物細胞結構識別SRB的檢測方法適用于菌群結構單一、環境體系簡單的檢測體系。

1.2 基于微生物代謝過程識別SRB的檢測方法

為提升檢測穩定性,研究以海洋腐蝕微生物SRB的特征代謝產物為識別目標,構建了一系列快速檢測技術。相關研究在保證了選擇性的同時,避免了使用生物識別材料出現的穩定性差、價格昂貴、非特異性吸附不可避免等缺點。主要研究進展如下:構建了SRB代謝產物無標記快速識別檢測技術,其中巰基蛋白酶活性條件檢測平臺 (圖4) 是基于硫化物與半胱氨酸蛋白酶的活性巰基位點作用抑制其催化活性進而實現SRB的檢測分析,既保證了檢測穩定性,又提升了檢測靈敏度[27];特異性微生物傳感器檢測平臺利用Thiobacillus thioparus細菌內的硫化氫脫氫酶,實現對SRB代謝產生的硫化物的特異性識別,大大提升了檢測穩定性[28];基于GSH-Au(Ⅰ)-Pb(Ⅱ) 配合物的熒光傳感器,是基于Pb2+誘導的GSH-Au(Ⅰ) 聚集誘導發光,以及硫化物導致熒光猝滅現象,可對SRB代謝產物產生特異性響應,從而實現對SRB的快速檢測[29];硫化鉛標記檢測平臺將無機合成與溶出伏安技術相結合,以原位生物硫化鉛為介體實現了目標微生物的靶向識別及快速檢測,具有良好的檢測性能[30]。

3c95e041-3222-4b48-88eb-e2271c6a72b1-F004.jpg

圖4   基于巰基蛋白酶抑制作用檢測SRB的原理及性能圖[27]


此外,構建了基于納米信標的SRB代謝產物快速識別檢測技術。其中,ZnS納米光催化檢測平臺將光催化過程應用于微生物快速檢測,構建過程融合了生物合成技術及光催化降解技術,既保證了檢測穩定性,又有效提升了檢測靈敏度[31];ZnO/ZnS陣列轉化檢測平臺 (圖5) 將納米陣列過程引入微生物檢測過程,借助納米陣列的轉化過程實現了SRB特征代謝產物的有效監測,該方法不受使用條件的限制,且具有批量生產的潛質[32];細胞代謝位發光平臺結合微生物納米合成技術在細胞內生成具有熒光特性的CdS納米量子點顆粒,實現了目標微生物的熒光成像及快速檢測。該檢測技術穩定、可靠,不受檢測條件的制約,具有很好的應用前景[33]。

3c95e041-3222-4b48-88eb-e2271c6a72b1-F005.jpg

圖5   基于ZnO/ZnS陣列轉化檢測平臺檢測SRB的原理圖及檢測性能[32]


基于SRB特征代謝過程的檢測技術避免了使用生物識別材料出現的穩定性差、價格昂貴、非特異性吸附不可避免等缺點。同時,通過特征代謝產物硫化物實現對SRB的特異性快速檢測還具有較高的普遍性,源自不同種群的SRB均可以通過這種方法檢測。然而,基于SRB特征代謝過程的檢測技術需要經歷一個SRB預培養過程以在培養溶液中富集足夠的硫化物,因此,需要借助納米材料或生物酶類的靈敏性和放大作用縮短檢測時間,這也是基于SRB特征代謝過程的檢測技術的進一步發展方向。

1.3 基于微生物特征遺傳片段的檢測方法

以提升檢測特異性及靈敏度,研究以微生物的特征遺傳片段為識別目標,通過PCR技術擴增目標微生物的特異性DNA片段,利用DNA識別探針對微生物特征DNA片段的高選擇性匹配、識別目標DNA片段,實現目標微生物的快速檢測。主要研究進展如下:構建了遺傳片段特異性放大檢測系統,其中核酸外切酶Ⅲ循環放大檢測平臺是一種新型的基于新型磁性-DNA雙鏈探針及核酸外切酶Ⅲ循環放大的檢測方法,通過在磁性微球表面修飾的磁性-DNA雙鏈探針,借助核酸外切酶Ⅲ特殊的剪切功能實現檢測信號的循環放大,該微生物檢測平臺的靈敏度高,選擇性好,簡單易操作,應用性廣[34];DNA納米生物條碼熒光檢測平臺 (圖6) 是通過利用細菌DNA提取試劑盒將細菌總DNA提取出來,并用特異性引物進行PCR擴增以獲得大量含有特異性目標片段的單鏈DNA,目標DNA鏈片段能部分與磁性微球的捕獲探針結合,未結合部分將與磁性微球的捕獲探針結合。通過磁性分離后,使用流式細胞儀測量結合有DNA-納米生物條碼的磁性微球[35]。

3c95e041-3222-4b48-88eb-e2271c6a72b1-F006.png

圖6   基于利用DNA納米生物條碼-熒光系統的檢測微生物原理圖及檢測性能圖[35]


此外,構建了基于新型酶標系統的遺傳片段特異性放大檢測系統,其中新型酶標體系信號放大檢測平臺 (圖7) 是一種基于溶菌酶催化作用的熒光DNA傳感器,溶菌酶被應用到微生物檢測研究中。利用細菌DNA提取試劑盒將細菌中DNA提取、擴增后獲得大量目標單鏈DNA片段,通過目標DNA鏈的“橋梁”作用將修飾有溶菌酶的信號DNA結合到磁性微球表面,溶菌酶催化底物產生熒光信號并用于微生物快速檢測[36];基于脫氧核酶識別的銀納米簇熒光傳感器,是以磁性微球為載體,以脫氧核酶為識別分子,引入乙酰膽堿酯酶,構建了一種MNP-DNAzyme-AChE (MDA) 復合物,用于微生物的高靈敏度檢測。在存在目標細菌裂解液條件下,脫氧核酶可與其特異性結合,并發生催化裂解,使連接其上的乙酰膽堿酯酶,從MDA復合物中脫離進入溶液。利用乙酰膽堿酯酶的催化產物,使DNA銀納米簇的熒光信號發生增強,可實現對微生物的高特異性、高靈敏度檢測[37]。

3c95e041-3222-4b48-88eb-e2271c6a72b1-F007.jpg

圖7   基于新型酶標體系信號放大檢測平臺檢測微生物原理圖[36]


基于微生物特征遺傳片段識別微生物的檢測方法具有極高的靈敏度和選擇性,其中,16S rRNA序列分析中的基因片段具有多拷貝的特性,一個細菌對應103~105條16S rRNA 鏈,使得基于編碼基因進行的分子生物學檢測更靈敏;其次,其具有多信息的特性,編碼基因由可變區和保守區組成,保守區為所有細菌所共有,細菌之間無差別,可進行細菌通用鑒定,可變區具有屬或種的特異性,可據此進行細菌鑒定。然而,此類方法操作復雜,對檢測人員技術要求高,且操作成本較高。因此,基于微生物特征遺傳片段識別的檢測方法適用于高專業技術支撐下對不同屬種微生物的特異性鑒別及檢測體系。

2 SRB生物膜代謝活性快速測定方法研究進展

為克服現有測定技術周期長,儀器復雜的缺點,本課題組研究開發了新型SRB生物膜代謝活性測定方法,借助電化學和熒光測試技術實現了SRB生物膜在形成初期的代謝活性動態測定與監測。


2.1 基于全固態離子電極測定SRB生物膜代謝活性

電化學技術能夠實現SRB生物膜代謝活性的動態、連續監測,然而現有的微電極系統操作繁瑣,設備昂貴。本課題組研究開發了兩種高柔韌性全固態離子選擇性電極,以石墨烯為離子-電子轉換層,并在其表面原位制備了硫離子和pH值選擇性薄膜,實現對目標離子的特異性、高靈敏度測定,同時研究還將其用于生物膜前期代謝活性的監測,獲得了材料表面SRB生物膜代謝活性的變化趨勢 (圖8)。

3c95e041-3222-4b48-88eb-e2271c6a72b1-F008.jpg

圖8   全固態硫離子選擇性電極的離子傳導示意圖及SRB生物膜代謝活性監測性能


2.2 基于熒光探針測定SRB生物膜代謝活性

本課題組研究開發了有機小分子硫化物熒光探針,不僅能夠實現對生物膜中硫化物的穩定檢測還能對其進行特異性熒光成像,解析SRB生物膜內代謝活性的空間分布狀態。此外,研究利用SRB細胞增殖過程中,呼吸鏈中的NADPH/NADP,FADH/FAD,FMNH/FMN和NADH/NAD的比值升高,SRB代謝中間體還原可將刃天青還原為具有強的熒光特性物質,利用此特點來測定SRB生物膜代謝過程的活性變化,并實現了SRB種群濃度和活性狀態的同時測定和對照分析 (圖9)。

3c95e041-3222-4b48-88eb-e2271c6a72b1-F009.png

圖9   熒光探針測定SRB生物膜表面種群濃度和生物膜代謝活性


3 結論及展望

針對腐蝕微生物SRB的快速檢測要比構建其它微生物檢測方法復雜,因為SRB種群多種多樣,分布廣泛,目前已經有13個屬,共計40余種SRB被報道出來。因此快速檢測海洋環境中SRB最重要的是選擇合適的識別方法。就目前的研究現狀,最合適的SRB識別方式是通過其特征代謝過程實現對SRB的特異性識別,因為抗體等生物識別材料的高選擇性限制了這些生物材料在SRB檢測中的使用,不可能使用一種生物材料檢測所有SRB種群的濃度;其次,生物印跡薄膜的選擇性程度較低,能夠產生干擾的物質較多。而且這兩類識別手段的非特異吸附問題無法得到較好解決,對檢測信號的干擾較大。通過特征代謝產物硫化物實現對SRB的特異性識別,在保證了選擇性的同時,避免了使用生物識別材料出現的穩定性差、價格昂貴、非特異性吸附不可避免等缺點。同時,通過特征代謝產物硫化物實現對SRB的特異性檢測還具有較高的普遍性,源自不同種群的SRB均可以通過這種方法檢測。

然而,這類檢測方法仍需較長的SRB培養時間以積累代謝產物硫化物。因此,進一步的研究將集中在繼續縮短檢測時間,主要是SRB培養時間方面,這對識別材料和檢測技術提出了更高的要求。


菠萝蜜国际一区麻豆